Cinkujj fehérjék módosítása – alkalmazási lehetőségek
Napjainkban jelentős erőforrásokat fordítanak genetikai eredetű (öröklődő, illetve rákos) betegségek gyógyításának kutatására. Ilyen célokra elsősorban specifikus mesterséges nukleázokat alkalmaznak, amelyek optimális működés esetén csak a kiválasztott DNS szekvenciát hasítják el. A jelenleg ismert...
Elmentve itt :
| Szerző: | |
|---|---|
| További közreműködők: | |
| Dokumentumtípus: | Szakdolgozat |
| Megjelent: |
2018
|
| Kulcsszavak: | cinkujj fehérje ATCUN motívum gélelektroforézis Cirkuláris Dikroizmus spektroszkópia |
| Tárgyszavak: | |
| Online Access: | http://diploma.bibl.u-szeged.hu/73256 |
| Tartalmi kivonat: | Napjainkban jelentős erőforrásokat fordítanak genetikai eredetű (öröklődő, illetve rákos) betegségek gyógyításának kutatására. Ilyen célokra elsősorban specifikus mesterséges nukleázokat alkalmaznak, amelyek optimális működés esetén csak a kiválasztott DNS szekvenciát hasítják el. A jelenleg ismert nukleázok azonban citotoxikus hatással is rendelkeznek, így fontos további fejlesztésük. A cinkujj fehérjék moduláris felépítésűek, és képesek különböző hosszúságú DNS szekvenciák felismerésére. Ezeket összekapcsolva egy endonukleázzal specifikus DNS hasítás idézhető elő. A szakirodalomban már jól jellemzett ATCUN motívum Cu(II) vagy Ni(II) komplexe képes lehet DNS-hasítást előidézni. Korábbi kutatásaink során sikerült kialakítani egy N-terminális ATCUN motívumot tartalmazó cinkujj fehérjét Ni(II)-indukált peptidhidrolízis révén. Jelen munkámban arra kerestem a választ, hogy az így létrejött fehérje alkalmas lehet-e egy mesterséges metallonukleáz szerepére, melyben a cinkujj egységek specifikusan felismerik a DNS-t, majd a fehérje N-terminális ATCUN motívuma elhasítja azt. Ennek kiderítésére elsőként optimalizáltam a reakciókörülményeket, és agaróz gélelektroforézis segítségével megvizsgáltam az egyes komponensek kölcsönhatását DNS-sel. Cirkuláris dikroizmus spektroszkópiával, ICP-tömegspektrometriával és izoterm kalorimetriás titrálásokkal tanulmányoztam a cinkujj fehérjénk fémkötő sajátságait. Géleltolódási vizsgálatokat felhasználva megállapítottam, hogy a fehérjénk képes specifikusan felismerni DNS célszekvenciáját. A korábban előállított cinkujj fehérje-Ni(II) komplex mellett alternatív útvonalon sikerült kialakítanom a fehérje Cu(II) komplexét is, amelyről igazoltam, hogy felhasználható DNS hasítási kísérletekben, mivel akár több napon keresztül is stabilis. Végezetül a fehérjefémkomplexekkel megvalósítottam plazmid DNS hasítását is, amely bizonyos mértékű szelektivitást mutat, de ennek egyértelmű igazolásához és optimalizálásához további kísérletekre lesz szükség a későbbiekben. Mindemellett diplomamunkámban egy kolicin-alapú cinkujj fúziós fehérjét felhasználva bemutatom, hogy a Ni(II)-indukált peptidhidrolízis alkalmas lehet allosztérikusan gátolt metallonukleázok aktiválására is. |
|---|